微生物的實驗可以分為兩大部分: 準備培養基和樣品檢驗。
事實上, 保持整個實驗室清潔是非常重要的, 這樣就不用在滅菌前擔心太多了, 然而, 滅菌后必須保證樣品或者培養基免受污染。其實, 可以把滅菌想像成”一扇門”, 在培養基中或者一些設備比如吸管的微生物都在滅菌過程中被殺死了, 沒有微生物困擾實驗了。必須保證滅菌后的環境(門后的部分)的潔凈, 杜絕滅菌后的培養基和設備受到污染。
無菌的重要性
無菌技術 – 高壓濕熱滅菌
|
要點 |
描述 |
|
原理 |
在壓力下產生的濕熱的蒸汽殺死微生物的營養體和孢子. |
|
密封 |
滅菌鍋必須密閉以阻隔外部空氣, 避免空氣的存在會影響壓力并降低滅菌鍋里面的溫度 |
|
滅菌壓力 |
在滅菌國內, 合適的滅菌溫度是通過壓力達到的, 壓力對于滅菌沒有效用但是使蒸汽溫度上升. 對于標準操作來說, 15lbs/inch2時的1210C并趕走所有空氣可以達到滅菌的效果 |
|
滅菌時間 |
當到達一定的溫度和壓力時, 需要保持一定的時間來達到效果, 為了殺滅微生物, 1210C必須保持至少15分鐘。 |
|
培養基的滅菌 |
大部分情況下, 實驗室配置培養基后應滅菌, 滅菌時應根據供應商指導, 使用合適的溫度時間; 有些培養基不適合滅菌的. |
|
器皿的滅菌 |
當滅菌那些器皿時, 需要考慮使用數量, 比如, 一天用10根吸管, 在滅菌時, 一般就可以以10根為一包, 這樣可以減低器皿在使用過程中遭受微生物的污染的可能性. |
|
滅菌條 |
在滅菌過程中, 可以用滅菌條來監控效果, 滅菌條在滅菌前是有顏色的, 滅菌后會變成黑色. |
|
重新滅菌 |
假如一次滅菌無效, 可以重新進行滅菌過程, 但是, 培養基是不可以進行第二次滅菌的, 應拋棄. |
|
儲存 |
滅菌完成后, 培養基和器皿應妥善儲存. 一般來說, 培養基應存放于避光的潔凈空間, 同時應參照供應商的指示. |
無菌技術 – 過濾 (Filtration)
|
要點 |
描述 |
|
簡述 |
物理分離方法, 使用高效過濾將微生物從液體培養基分離 使用于對熱敏感的培養基和化學品, 比如, 當需要酒石酸來調節OSA的酸度時 由于不需要加熱和冷卻過程, 過濾比高溫濕熱滅菌省時間, |
|
過濾頭 |
0.2微米的過濾頭可以分離所有的細菌營養體, 把它安裝在針筒末端. |
無菌過程注意點
|
要點 |
描述 |
|
綜述 |
一旦培養基或者器皿經過滅菌過程, 這種滅菌狀態應保持直到實驗結束. |
|
區域 |
最好能把培養基準備區域(門外)和實驗區域(門內)分開. |
|
工作臺面 |
工作前必須消毒, 可以用70%的酒精, 也可以用含氯的消毒劑. |
|
消毒時間 |
不管使用何種消毒劑, 需要提供充分的消毒時間來殺滅微生物, 一般5-10分鐘. 可以用紙巾擦干表面 |
|
潔凈臺 |
必須有2個光源: 普通照明用和殺菌紫外光. 紫外燈用于保持工作臺面免于微生物污染. 在使用前仍然需要使用消毒劑清潔. |
|
擺放 |
應該有好習慣把工作桌面的物品擺放好, 把移動放到最低限度, 避免帶來污染 |
|
鑷子 |
如果使用薄膜過濾法, 需要準備一個小燒杯并有少量酒精, 鑷子不用時就放在杯子里 |
|
培養基 |
培養基使用前, 應該有相關日期, 比如配置日期, 或者實驗室收到日期(直接使用的培養基). 假如沒有所需日期, 這個培養基不能使用. |
|
實驗服 |
穿著干凈的實驗服, 袖子應卷起至肘部以避免碰到培養基或樣品帶來污染, 當然, 做實驗前要洗手. |
實驗的無菌技術注意點
|
采樣 |
個人衛生 |
酒精燈 |
||
|
樣品應無菌采得 使用無菌采樣袋或者采樣瓶 采樣員應戴防護手套, 在采樣前燒采樣口 樣品容器應緊閉并安全儲存. |
萬一培養基或者樣品濺到實驗服上, 應在做完一個實驗后換上干凈的 咳嗽或者鼻塞可能會帶來微生物并影響實驗, 應戴好防護手套面罩.
|
使用本森燈或者酒精燈, 在實驗前點燃 火焰在實驗區域產生一個防護層, 可以防止那些懸浮在空氣中的微生物掉落在工作臺面上或者培養基上. |
||
|
開瓶 |
瓶口 |
培養皿 |
||
|
開瓶前, 應用清潔劑的紙巾清潔瓶蓋和附近區域, 除去蓋子上可能留存的微生物 |
蓋子打開后, 玻璃瓶口應進行滅菌, 可以在酒精燈上方旋轉瓶口和螺紋, 一般2-3秒. |
當打開培養皿時, 不能完全移除蓋子, 而應該保持在培養皿的上側, 從而能夠倒入培養基或者樣品, 這樣可以減少空氣灰塵或者微生物的污染; 倒完培養基或者樣品后, 瓶口重新過火, 蓋蓋子, 用消毒劑清潔. |
||
|
濾膜 |
鑷子 |
|||
|
打開薄膜包裝, 絕對不能碰到薄膜! 用鑷子把薄膜移除包裝并放到過濾頭上, 過濾的漏斗不能完全移開, 只需移開一點點放入濾膜即可 過濾完后, 用鑷子把濾膜轉到培養皿中, 放置于中間 |
用鑷子轉移濾膜 過火時, 拿住鑷子的尾部, 放到火焰上, 保持一下能夠到火就好, 時間太長會在尖部結碳 拿鑷子的時候, 尾部向上直至燒完. |
|||
|
實驗結束 |
打掃 |
廢棄物 |
|
實驗結束后, 培養皿放入培養箱; 剩余的培養基可以放回儲存區域, 蓋子必須蓋緊 |
拋棄廢棄物, 比如樣品袋; 可回用的物品放在遠離工作區域的地方以回收, 清洗, 滅菌. 用含有消毒劑的紙巾清潔工作臺面. |
在實驗過程中暴露于微生物的物品應作為有害廢棄物 這些廢棄物可能含有微生物并致病; 假如含有致病菌可能會產生公共衛生的事件. 最好廢棄物能夠進行濕熱滅菌 |
一個設計合理的實驗室能提供一個合格的環境以支持實驗能夠安全有效地進行. 首先, 需要為實驗室選擇一個合適的物理位置:
遠離其他操作區域, 比如, 生產或者儲運；
沒有從其他區域進入實驗室的直接入口；
實驗室必須是微生物實驗專用；
實驗室應分為準備區域和測試區域. 濕熱滅菌鍋, 作為這兩個區域的典型的分隔(門). 這種分隔保證了能有效使用無菌技術并幫助防止培養基和樣品的交叉污染；
假如兩個區域無法分開, 實驗室應根據實驗準備和測試兩個行為來區分不同的區域。
|
通風和氣流 |
安保 |
工作區域 |
|
微生物實驗室應該有單獨的通風系統, 與其他操作區域的空氣供給分開; 房間應該是負壓的, 這表示實驗室里面的空氣永遠是向內流動的; 空調系統的排氣必須直接排出實驗室, 空調系統應定時清洗, 并關注空氣過濾器的清潔 |
實驗室應該是限制進入的, 可以是卡片控制或者其他方式, 只有那些被允許進入實驗室的人員才能進入 |
實驗室人員應該有充足的工作區域, 從GLP標準來說, 每人應有20平方米的區域. 充足的工作區域可以避免工作中人員的碰撞, 也避免了交叉污染. |
|
易清潔 |
門和窗 |
照明 |
|
實驗室的墻面, 屋頂和門都應該是平滑的, 光潔易于清洗消毒的; 墻的接縫包括強和墻之間, 強和地面之間應該是弧形的 任何地方都應該不能聚集灰塵, 例如窗臺或者窗簾 柜子應該是可移動的或者是不著地的以方便清掃. |
窗戶應密封, 門應緊閉以避免外面空氣進入實驗室 如果窗戶壞了或者有裂縫額, 應及時報修, 并盡快修好 |
實驗室應有充足的照明, 包括不間斷電源或者備用發電機. |
遵照GLP相關的安全規則
1.GLP要點 – 工作區域
|
要點 |
描述 |
|
總體安排 |
實驗前應做好儀器, 試劑和培養基的所有準備工作, 這樣可以合理利用時間并得到穩定的實驗結果 |
|
桌面安放 |
多余的培養皿, 燒瓶或者濾紙可能會干擾實驗并帶來潛在的濺出, 打碎或者交叉污染. |
|
實驗前消毒 |
在配制培養基或者開始試驗前, 應該清潔并消毒工作桌面. 最佳的消毒劑是70%的酒精溶液, 含氯水的溶液, 或者公司批準的其他消毒劑. 最好使用一次性的消毒紙巾, 不能使用毛巾或者海綿. 清潔后, 應等待幾分鐘以使有充分的時間殺滅微生物, 可以用紙巾擦干. |
|
試驗后消毒 |
實驗結束后, 徹底清潔工作區域, 仍然使用70%酒精溶液或者公司批準的其他消毒劑, 保持一段時間, 然后擦干 |
|
有害廢棄物的處置 |
必須有效管理微生物的有毒廢棄物, 任何和微生物培養或者培養基相關的物品都應被看作有害物質; 因為他們可能含有致病菌, 需要小心處理 |
|
廢棄物的滅菌 |
濕熱滅菌是最簡單也是最有效的處理污染物質和有害物質的方法. 用過的培養皿應放在滅菌袋中. 滅菌后, 可以當作一般廢棄物處理 |
|
重復使用器皿的滅菌 |
當需要對小件物品(比如移液管)滅菌時, 可以根據實際用量分組包裝. 濕熱滅菌后, 袋包裝冷卻并保存. |
|
避免浪費 |
合理安排是非常重要的; 實驗室工作需要精準, 但是有時候我們也需要快速工作, 因為花非常多時間會延長設備, 培養基, 或者樣品暴露在環境中的時間. 把需要用的物品放在手邊可以用的地方可以節約時間并提高工作的有效性. |
2.GLP要點 – 潔凈工作臺
|
簡介 |
使用 |
監控 |
|
潔凈工作臺提供了控制來自環境的污染并提供工作區域的潔凈空氣. 潔凈空氣吹向工作區域, 同時, 可以避免外部空氣進入工作區域 |
使用時, 紫外光線(或者紫外燈)應關閉, 但是使用后應打開. 如果紫外燈沒有打開工作臺沒有開啟, 工作臺不能開始使用; 必須清潔工作臺, 開啟電源并打開紫外燈, 保持30分鐘. |
潔凈工作臺需要進行日常的確認, 一般有第三方公司進行. |
應該是一個安全的實驗室. 假如疏忽安全的話, 許多每天使用的培養基或者設備會產生危害. 減少這些危害帶來的風險不僅僅保護了工作場所, 更重要的是, 保護了自身免于危險。
利用常識并遵照GLP相關的安全規則, 我們就能把由于微生物相關的行為帶來的潛在危害降低到最小。
|
安全用品 |
移動 |
|||
|
安全用品包含口罩, 手套和眼部防護. 口罩防止培養基和樣品受到污染, 可能來自于咳嗽或者鼻涕; 根據當地的要求和習慣, 每個實驗室會有不同的要求 戴手套是為了防止培養基或者其他刺激性物質接觸皮膚; 在從濕熱滅菌鍋內取出容器或則器皿時, 需要戴防熱手套 在配置培養基和實驗中佩戴防護眼鏡是一個很好的習慣, 能夠購買帶有屈光度的防護眼鏡為佳. |
當移動培養基或者樣品時, 應小心注意以避免濺出或者潑出; 突然的移動會產生安全危害或者導致實驗無效 不要使用夸張的動作或者行為 同時, 不要把任何東西, 比如吸管, 放到嘴里 |
|||
|
明火 |
濕熱滅菌鍋 |
|||
|
實驗中需要用到酒精燈或其他明火, 但是假如使用不當會帶來比較高的安全危險 確保酒精燈不用時完全關閉, 當有閥門時經常檢查墊圈是否有裂痕或者泄露. 操作酒精燈時, 應確保火焰不會接觸衣物或者皮膚. 可燃物品, 比如記錄本, 應遠離火焰以避免意外點燃. 同時, 要注意可燃液體的容器. 每次使用后應蓋好蓋子并遠離酒精燈火焰 使用火焰進行滅菌工作時, 可使用鑷子. 把鑷子放在含有95%酒精的燒杯中, 使用時, 把鑷子在火焰上灼燒1-2秒, 移開鑷子并等待火焰熄滅. 拿著鑷子是尖端應向下, 使熱的酒精不會流到手上. |
濕熱滅菌鍋使用高壓下產生的蒸汽, 溫度可達1210C, 殺死了微生物, 同樣可以帶來人類組織的灼傷, 所以必須特別小心地操作; 如此高的溫度以及蒸汽能帶來極大的潛在傷害, 即使是殘留的蒸汽也能帶來很大的危險. 打開滅菌鍋時需要特別小心, 站在邊上避免面對熱量和蒸汽, 緩慢的打開門, 同時, 戴好防熱手套. 把需要滅菌的培養基和器皿平均放置在托盤上, 大的物品放在邊上, 確保物品不會相互碰撞. 這樣可以是熱量均勻擴散并平衡整個托盤 |
|||
|
潔凈臺 |
樣品操作 |
|||
|
在潔凈臺工作時必須關閉紫外燈. 紫外光線是危險的, 不要把手或者手指放在紫外燈下, 以免灼傷皮膚; 不要直接看紫外光線以免損傷眼睛 |
培養基和樣品: 用火焰灼燒瓶口時, 停留4-5秒, 旋轉使整個表面都能被灼燒, 不要停留太久, 不要濺出樣品或者培養基 假如樣品是瓶裝的, 不要直接灼燒以免爆開. 可以取2個燒杯, 倒入70%酒精, 把瓶子倒置放入一個燒杯中, 使蓋子和瓶頸的2.5厘米處能浸沒在酒精中, 拿出瓶子用干凈的布擦干; 同理, 放入第二個燒杯, 拿出瓶子直立待酒精自然蒸發. 開瓶時應特別小心不能污染樣品, 可以用消毒紙巾開旋蓋的瓶子; 用浸沒在95%酒精并灼燒的開瓶器打開壓蓋瓶. 打開瓶子后, 使用相同的方法灼燒瓶口, 并確保用于消毒的酒精完全揮發. 拉罐可以使用相同的程序或者用含70%酒精的棉球擦拭頂部, 假如罐子必須用開罐器, 這個開罐器操作同開瓶器. 無菌包裝的產品用含70%酒精的棉球擦拭. |
|||
1.一級防護（設備）
1.1移液輔助器，如移液器
1.2生物安全柜
1.3一次性塑料接種環、電熱接種環
1.4螺口蓋試管及瓶子
1.5高壓滅菌器
1.6一次性塑料移液管
2.二級防護（人員）
2.1工作服、防護服
2.2手套（乳膠手套等）
2.3安全眼鏡、面罩或其他防護用品
——————常見問題Q&A——————
細菌和霉菌培養箱必須分開放置嗎？
在CNAS-CL09:2013《檢測和校準實驗室能力認可準則在微生物檢測領域的應用說明 》有此規定：5.3.3 e)檢測樣品中的霉菌時，要有適當的措施控制孢子在空氣中的擴散。但未見到明確規定細菌培養箱和霉菌培養箱不能在同一房間的規定。一般實驗室都有三種培養箱，結構設計上分為兩種，一種是內部循環風溫度平衡的，第二種是內外熱空氣流動自動平衡型的，另外第三種是熱輻射溫度平衡型的。有網友認為，第一種和第三種應該可以放在一個實驗室，保持一定距離即可。第二種培養箱應該不能放在一個實驗室。據說，CNAS現場評審，會提出細菌和霉菌培養箱分開放置要求。
防止培養基長霉的方法
當環境溫度不適應果蠅生長時(溫度低于18℃) ,培養基接種后的7d內,特別容易長霉。
要避免長霉,應注意:
①培養果蠅的器皿要嚴格消毒。培養瓶洗干凈后,自然涼干, 再與棉塞一道進行高溫干燥滅菌(120℃, 30min) 。
②培養基營養要全面。果蠅培養基的種類很多,本實驗室用的是玉米培養基,配方如下:水750mL煮開,加瓊脂6. 2g,待瓊脂溶解后加白糖62.5g,攪拌溶解后加調成糊狀的玉米糊(玉米粉82. 5g,用冷水調成糊狀) ,煮開2～3min,加酵母粉7g,加熱1～2min,攪拌均勻后,移去火源,加丙酸2mL (起殺菌防霉的作用) 。培養基稍稍冷卻后,倒入已滅菌的培養基瓶中,盡量不要讓培養基粘在瓶壁上,塞好棉塞,放入仍有余熱的干燥箱中將瓶壁上的水蒸干。
③接種時消好毒。在無菌室內接種, 如沒有無菌室, 在接種前用75%酒精棉球擦雙手一遍。接種后,放入適宜果蠅生長溫度的培養箱中培養果蠅(溫度20～25℃) ,一旦下一代成蠅孵出來后,培養基就不易長霉。
一般微生物實驗室只有一個培養室，而用于微生物培養的培養箱一般是內循環的。所以是可以同一個房間的。
