1 蛋白質(zhì)組學(xué)概述
“蛋白質(zhì)組”一詞的英文是Proteome，它是proteins 和genome 兩個詞的組合，意思是proteins expressed by a genome，即為基因組表達的蛋白質(zhì)[1]。蛋白質(zhì)組的概念是1994 年由Wilkins首先提出，并首次在1995 年7月的“Electrophoresis”上發(fā)表，指“一個細(xì)胞或一種組織基因組所表達的全部蛋白質(zhì)”[2]， 蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics) 是從整體水平上研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的組成及其活動規(guī)律。與基因固定不變的基因組不同，蛋白質(zhì)組作為相應(yīng)基因組所表達的產(chǎn)物隨時間、地點、環(huán)境等條件變化。在同一機體不同的組織和不同細(xì)胞中、蛋白質(zhì)的種類、數(shù)量不同； 即使同一組織或細(xì)胞在不同的發(fā)育階段、生理狀態(tài)、甚至不同的外界環(huán)境下，其蛋白質(zhì)組也是在不斷的變化之中； 在病理或治療過程中， 與正常生理過程也不同。因此， 蛋白質(zhì)組是一個動態(tài)的概念。其目的是從整體的角度分析機體內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成分、表達水平、修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用和聯(lián)系， 揭示蛋白質(zhì)功能與生命活動的規(guī)律。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究分為3 方面: (1) 蛋白質(zhì)大規(guī)模鑒定和轉(zhuǎn)錄后修飾的微特征研究。(2) 差異顯示蛋白質(zhì)組學(xué)，即蛋白質(zhì)表達水平的研究， 對腫瘤等疾病的應(yīng)用有著廣闊的前景。(3) 蛋白質(zhì)間相互作用和翻譯后修飾的研究[3]。分析不同蛋白質(zhì)的表達可用來比較正常組織和腫瘤組織之間的差別，蛋白組學(xué)將成為鑒別疾病的標(biāo)記物，可以闡述某種機制，這種機制在越來越多的分析中被應(yīng)用。人類的基因組比預(yù)期要小的多，并且基因組計劃中的腫瘤相關(guān)基因現(xiàn)在才被知道，然而較小的基因不能反映單一的蛋白質(zhì)組。通常，廣泛的翻譯后修飾例如磷酸化、糖基化，蛋白水解處理作用都是很常見的方式。蛋白質(zhì)翻譯后修飾能夠顯著地改變蛋白質(zhì)的功能，因此可以表達出細(xì)胞和組織特征。因此，在基因組中，蛋白組學(xué)的挑戰(zhàn)之一就是通過蛋白效應(yīng)器的知識理解組織特征，并且把它應(yīng)用到臨床中。
2蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法
蛋白質(zhì)組學(xué)可以利用蛋白微數(shù)列、電泳和質(zhì)譜分析法檢測、識別和特征標(biāo)記的蛋白進行分析。這些方法有其獨特的優(yōu)點和局限性，根據(jù)各自能力評估蛋白質(zhì)組譜。
2.1蛋白微數(shù)列技術(shù)
蛋白微數(shù)列是將大量抗體或者大量組織蛋白質(zhì)樣品一次標(biāo)記在載玻片上進行檢測分析。這種方法能夠檢測大量蛋白質(zhì)的存在或者大量組織樣本表達的水平，但是這種技術(shù)在特異性和敏感性抗體的可用性方面是有限的。此外抗體的特異性必須通過免疫印跡證實，并且需要內(nèi)部的對照，尤其是抗體的微數(shù)列沒有預(yù)測的親和力和特異性。盡管如此，大量商品化抗體的應(yīng)用使得應(yīng)用蛋白微數(shù)列成為可能。
2.2 雙向凝膠電泳
雙向電泳在1975年由O’Farrell發(fā)明,其原理是：第一向基于蛋白質(zhì)的等電點不同，用等電聚焦分離.第二向則按分子質(zhì)量的不同用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠把復(fù)雜蛋白混合物中的蛋白質(zhì)在二維平面上分離，這種方法尤其適用于分子量相似的蛋白質(zhì)。采用蛋白質(zhì)組重疊群 , 即利用多個不同pH梯度和分子量上相互重疊的2-DE 圖譜, 拼接成一張完整2-DE 圖譜, 大大提高了分辨率和進樣量, 這對于低豐度蛋白的檢出十分有利。個別蛋白質(zhì)可以被染色水解為肽，這些可以通過質(zhì)譜分析法進行分析。肽的酶解圖譜可以根據(jù)蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)庫進行分析。
2.3 質(zhì)譜分析法
蛋白組學(xué)主要的工具之一就是質(zhì)譜分析法。這種方法是將基因轉(zhuǎn)變成氣體離子后，根據(jù)投料比例分析蛋白質(zhì)。吸解作用和離子化技術(shù)例如基質(zhì)輔助的激光解吸離子化技術(shù)，為檢測和分辨蛋白質(zhì)提供了高水平的敏感度和精確度，這種技術(shù)的高敏感度和樣品的簡化使得這項技術(shù)便利化，但是它也存在局限性。分析復(fù)雜的樣品例如血清相比檢測蛋白困難大的多。
3 蛋白組學(xué)的分析儀器比較
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方法 |
原理 |
優(yōu)點 |
缺點 |
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電泳 |
水溶性的蛋白根據(jù)電場的原理從負(fù)極向正級移動，移動的速率取決與其電荷、大小和形狀。 |
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蛋白被識別之前凝膠劑肯定被染色，凝膠劑染色本身沒有用處，如果沒有另一種檢測技術(shù)的使用，諸如免疫印跡或者質(zhì)譜分析技術(shù)，蛋白不能被精確地鑒別。 |
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SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳
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蛋白質(zhì)移行通過惰性聚丙烯酰胺凝膠，孔徑大小的可調(diào)節(jié)性可阻止蛋白，SDS是負(fù)電荷的洗滌劑，它可以展開蛋白質(zhì)的分子鏈，成為游離的分子，蛋白質(zhì)以不同的速率向正極移行。 |
分離所有類型的蛋白質(zhì)，甚至那些非水溶性的蛋白質(zhì)。 |
一維分離方法分離是有限的。接近傾向重疊，僅能解決小分子量的蛋白質(zhì)。 |
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二維凝膠電泳
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第 1 相電泳是根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點不同在p H 梯度膠中進行等電聚焦電泳。第 2 相電泳根據(jù)蛋白質(zhì)等電聚焦的原理，根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的大小在凝 膠 電 泳 ( SDS-PAGE)進行蛋白質(zhì)分離 。 |
同多種蛋白凝膠電泳相比，這種方法分離混合物分辨率高，根據(jù)圖像分析比較便利，蛋白質(zhì)分解的大約每毫升1ng。 |
高豐度蛋白存在可能是模糊的（例如白蛋白、免疫球蛋白）低豐度蛋白的分離蛋白質(zhì)需要從凝膠中移除斑點，消化，利用質(zhì)譜分析法分析肽，它不能分辨小分子重的蛋白質(zhì)(<10，000 Da)。不能順從多變的分析。 |
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二維熒光差異凝膠電泳
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二維電泳使用不同的青藍燃料從不同的樣品中標(biāo)記蛋白，在不同的光的波長發(fā)生酶倍增免疫測定技術(shù)，混合樣品中達到三種的樣品能夠被標(biāo)記（測試、對照、參考） |
從混合物中分析不同的蛋白質(zhì)這種方法很簡單，在單一的凝膠中可以得到蛋白質(zhì)表達的速率，在每一個凝膠或者是不同凝膠之間變化的復(fù)位由一個內(nèi)部的標(biāo)準(zhǔn)，非常敏感。 |
高豐度蛋白存在可能是模糊的（例如白蛋白、免疫球蛋白）低豐度蛋白分離蛋白質(zhì)最終需要從凝膠中移除斑點，消化，利用質(zhì)譜分析法分析肽，許多斑點不能辨別，因為材料的缺乏，它不能分辨小分子重的蛋白質(zhì)(<10，000 Da)。 |
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蛋白質(zhì)芯片多種蛋白質(zhì)的芯片、細(xì)胞因子芯片、組織微數(shù)列 |
已知的蛋白質(zhì)局限到一個表面（念珠、硝酸纖維素），利用免疫測定的原理檢測。 |
高敏感率和處理量，多種分析物可以同時測定。 |
有限抗體的有效性和特異性需要一些先前蛋白質(zhì)表達的知識。可能不能檢測分析亞型。 |
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基質(zhì)輔助的激光解吸離子化-飛行時間-質(zhì)譜技術(shù)
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決定蛋白質(zhì)或者肽片段的精確積聚。蛋白質(zhì)或肽片段是由有機酸間質(zhì)混合而成的，在金屬載玻片上干燥，激光離子化破壞肽類片段， 這可以使得在電場中向檢測器方向移動。到達檢測器的時間取決于電荷和形狀。通過質(zhì)譜分析技術(shù)可以獲得肽類的遺傳信息。 |
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最大的測定分子量<3000Da |
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蛋白質(zhì)芯片表面增強激光解析電離-飛行時間-質(zhì)譜技術(shù)
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與基質(zhì)輔助的激光解吸離子化-飛行時間-質(zhì)譜技術(shù)比較，不同點在于它使用了色譜技術(shù)，從復(fù)雜試樣中，有選擇的結(jié)合蛋白質(zhì)亞型。
沖洗移去表面非特異性凝結(jié)蛋白質(zhì)和其他物質(zhì)，這些物質(zhì)可以干擾離子化的進程。（鹽，去污劑等） |
高流通量病毒免疫測定自動化；樣本量最小；初步分離原材料可以增強低豐度蛋白的檢出率。
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不能直接辨別蛋白質(zhì)。對高分子量蛋白質(zhì)（分子量>20 kDa）不敏感。 |
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穩(wěn)定同位素標(biāo)記
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生物樣本使用不同的穩(wěn)定同位素，這些同位素使用變調(diào)劑靶向于一種特異性的氨基酸。介于分離和質(zhì)譜分析法之后，兩個不同樣本的肽在不同質(zhì)量單位的特異同位素中使用，能獲得相對量化。 |
蛋白組學(xué)比其他方法普及。在大量的蛋白質(zhì)中能獲得度量信息。通常能獲得相關(guān)蛋白的識別數(shù)據(jù)信號。 |
高技術(shù)要求，低處理能力。樣本在檢驗前需經(jīng)過胰蛋白酶處理。這種可靠的方法適合于檢測大量蛋白質(zhì)。 |
